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明膠酶譜法試劑盒
描述：基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,mmp)以無活性的酶原形式分泌，活化后能夠降解細胞外基質的膠原蛋白，又稱膠原酶。通過影響細胞外基質，膠原酶參與胚胎發育、形態發生、組織-等過程，并參與-、心血管、神經等許多-過程。血漿與組織中的mmp-2、mmp-9參與各種生理與病理過程，其在-診斷和中的意義日益受到重視1。
本試劑盒采用酶譜法(zymography)檢測mmp-2、mmp-9活性。zymography是一種廣為使用的、基于sds-page電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法，其靈敏度可達1 nm，高于elisa方法2，其基本原理和程序是：制備加有膠原酶底物的sds-page凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電泳，電泳結束后取出凝膠與酶反應buffer孵育，凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區域，從而能同時指示mmp-2、mmp-9的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供
mmp-2、mmp-9特異蛋白底物及酶學反應緩沖液，可檢測少至0.1~0.5μl-中的mmp-2、mmp-9酶譜及活性，檢測靈敏度~1 nm。試劑盒可進行50次標準小膠檢測，如果小膠加樣孔為10~15個，則總計可檢測500~750個樣品。
明膠酶譜法試劑盒
適用:檢測mmp-2、mmp-9酶譜及活性detect mmp2&mmp9 as low as 1 nm。組成與儲存(50 assays)：
1.2×sds-page non-reducing buffer 1.5 mlμl,?20oc；
2.10×substrate g,50 ml,?20oc；
3.10×buffer a,50 ml,4oc,使用時用蒸餾水稀釋；
4.10×buffer b,50 ml,4oc,使用時用蒸餾水稀釋；
5.sds-page凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液(#p1501),4oc。
檢測步驟：
1.制備含mmp底物蛋白的sds-page凝膠：分離膠濃度為8%。按照標準程序制備sds-page凝膠。將10×substrate g融化，并90oc加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10×substrate g并使之稀釋10倍，混勻后加入過-銨和temed，等待凝膠聚合。
2.待測樣品1:1稀釋于2×sds-page non-reducing buffer(用完后可自行配制：4%sds,100 mm tris-cl ph6.8,20%glycerol,0.02%bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過預試驗確定加樣量，使用普通蛋白預染marker即可。陽性對照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl全血與100μl 2×sds-page non-
reducing buffer等體積混合，取5-15μl上樣。
3.低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20 ma/gel。溴酚藍跑出凝膠時結束電泳。
4.洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內。可先用適量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10 ml
1×buffer a(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠2×30分鐘。中間換液。
5.孵育：倒掉buffer a。加入10 ml 1×buffer b(蒸餾水稀釋)，室溫或37oc孵育1~5小時。陽性對照或者血中的mmp通常37oc孵育1小時即可顯示。如mmp活性低，應延長孵育時間為10小時或過-。
6.顯色：倒掉buffer b，加入sds-page凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液操作步驟見sds-page凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液說明書。凝膠的大部分區域被深染，在有mmp條帶的位置不被染色而形成透亮區域。透明區域的位置和范圍指示mmp-2、mmp-9的大小位置(酶譜)及活性。陽性對照將在66~72(mmp-2)、92(mmp-9)、130(prommp-9)、225(prommp-9)kda位置出現透明條帶。
7.條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然mmp條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調整背景顯示為灰度顯示，并盡量設置為黑色。mmp條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是常見的格式。
明膠酶譜法試劑盒
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