microrna芯片:
rna干擾(rna interference， rnai)現(xiàn)象是一種進化上保守的抵御或外來---qin犯的防御機制。將含有靶基因mrna同源互補序列的rnadouble strand rna，---怎么做， dsrna導入細胞后，能夠特異地識別該mrna，引起mrna的降解，從而導致相應的功能缺失。rnai提供了一種經(jīng)濟、快捷、gao效的抑制特異基因表達的技術(shù)手段，該技術(shù)已被廣泛用于研究基因功能和chuan染性---及惡xingzhong瘤基因zhi療領(lǐng)域。目前常用的rna干擾手段為mirna、 shrna和sirna等。
mirna是一類可以通過rnai機制調(diào)節(jié)基因表達的內(nèi)源性小rna，人工mirna與shrna的設(shè)計原理基本相同，由于mirna具有內(nèi)源性，因此其更易產(chǎn)生有效的基因沉默。
技術(shù)流程：
dsrna或pre-mirna被導入細胞后，能夠被一種特異的---內(nèi)切酶dicer識別并切割成為小片段，這些片段在rna解旋酶的作用下解鏈。繼之反義鏈在與體內(nèi)一些酶包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等結(jié)合形成rna-的沉默復合物rna-induced silencing complex，risc，risc與mrna同源區(qū)進行特---結(jié)合，若mirna與mrna的結(jié)合位點配對，綿陽pcr，則切割mrna；若mirna與mrna的結(jié)合位點不配對，則抑制mrna的翻譯。
3、參數(shù)設(shè)置
使用488nm激發(fā)波長，---多少錢，525nm發(fā)射波長，實時或逐時間點檢測---前后熒光的強弱。dcf的熒光光譜和fitc非常相似，可以用fitc的參數(shù)設(shè)置檢測dcf。dcf的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考下圖。
4、其它說明
陽性對照可以按照1：1000的比例使用。例如裝載好探針的細胞共1毫升，可以加入1微升的陽性對照---。通常---后20-30分鐘內(nèi)可以觀察到非常---的活性氧水平升高。對于不同的細胞，活性氧陽性對照的效果可能有較大的差別。如果在---后30分鐘內(nèi)觀察不到活性氧的升高，可以適當提高活性氧陽性對照的濃度。如果活性氧升高得過快，可以適當降低活性氧陽性對照的濃度。
另外，對于某些細胞，如果發(fā)現(xiàn)沒有---的陰性對照細胞熒光也比較強，可以按照1：2000-1：5000稀釋dcfh-da，使裝載探針時dcfh-da的濃度為2-5微摩爾/升。探針裝載的時間也可以根據(jù)情況在15-60分鐘內(nèi)適當進行調(diào)整。
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