16.長鏈引物為什么出錯的幾率非常高？
答：引物合成時，每一步反應(yīng)效率都不能達到100%，產(chǎn)生堿基插入、缺失、置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失，這種心情可以理解。但是-pcr擴增，不可能-擴增產(chǎn)物中沒有突變，引物合成也不可能-100%正確。要知道，引物合成中發(fā)生錯誤非人為因素的頻率，比任何高保-溫聚合酶pcr擴增過程所產(chǎn)生的頻率都要高。做引物合成，長鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準(zhǔn)備。
17.如果測序發(fā)現(xiàn)突變，該如何處理？
答：遇到這種情況，首先和-合成廠家取得聯(lián)系，生產(chǎn)人員會檢查生產(chǎn)的原始記錄，主要是核對合成序列是否和定單一致，他們在電腦中一般會保留所有原始數(shù)據(jù)。在確認引物合成序列沒有輸錯的情況下，資陽pcr，建議重新挑取測序，可能會找到正確的。根據(jù)經(jīng)驗，40個堿基以下的引物，測1-2個就可以了；40個以上的-是用于全片段拼接合成的，就需要多測一些了。一般情況下，每個突變的位點都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。也可以要求公司將引物免費重合一次，不過重合的引物和次的引物一樣，都可能含突變，不會因為重合的引物就減少您的遇到問題的幾率。基因拼接過程中，如果發(fā)現(xiàn)一段區(qū)域突變點不多，就多測幾個，否則就重合一下引物。
emsa實驗
emsa:凝膠遷移或電泳遷移率檢測是一種檢測蛋白質(zhì)和dna序列相結(jié)合的技術(shù)，-，初用于研究dna結(jié)合蛋白和其相關(guān)的dna結(jié)合序列相互作用，可用于定性和定量分析。分為2種類型：同位素標(biāo)記探針，非同位素標(biāo)記探針。
通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32p同位素標(biāo)記的dna或rna探針一同保溫，在非變性的聚bing烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。dna-復(fù)合物或rna-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動得慢。同位素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當(dāng)檢測如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的dna結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細胞抽提液。在檢測rna結(jié)合蛋白時，pcr實驗室，依據(jù)目的rna結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結(jié)合序列的dna或rn片duan和gua核苷酸片段特異，和其它非相關(guān)的片段非特異，來確定dna或rna結(jié)合蛋白的特-。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的特點和強度來確定特異結(jié)合。
單細胞rna測序
單細胞rna測序也稱scrna-seq。通常而言，一般的組織細胞rna-seq實驗會產(chǎn)生1000萬個讀數(shù)，如果一個基因的頻率超過50rpkm，即每百萬讀數(shù)中每千個堿基中超過50個，這一基因即被認為有表達。泊松分布下，實時熒光定量pcr，1kb長的基因有超過500個讀數(shù)和4%的小變異系數(shù)，即cv值；哺乳動物細胞通產(chǎn)含有200，000個mrna，因此至少要用50個單細胞一起才能到達小cv值；考慮到逆轉(zhuǎn)錄的效率和環(huán)境干擾等因素，為得到準(zhǔn)確的表達和細胞種類的識別，需要使用的細胞數(shù)量實際要更多。
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