三、自噬過(guò)程進(jìn)行觀察和檢測(cè)
1、觀察自噬體的形成
由于自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。phagophore的特征為:新月?tīng)罨虮瓲�，雙層或多層膜，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，有包繞胞漿成分的趨勢(shì)。自噬體(av1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。自噬溶酶體(av2 )的特征為:單層膜，胞漿成分己降解。( autophagic vacuolo av )
2、在熒光顯微鏡下采用gfp-lc3融合蛋 白來(lái)示蹤自噬形成由于電鏡耗時(shí)長(zhǎng)，不利于監(jiān)測(cè)(monitoring) 自噬形成，人們利用lc3在自噬形成過(guò)程中發(fā)生---的現(xiàn)象開(kāi)發(fā)出了此技術(shù)。無(wú)自噬時(shí)，gfp-lc3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時(shí)，gfp-lc3融合蛋白轉(zhuǎn) 位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體，可以通過(guò)計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)自噬活性的高低。
3、利用western blot檢測(cè)lc3-ii/比值的變化以評(píng)價(jià)自噬形成自噬形成時(shí)，胞漿型lc3 (即 lc3-i)會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即lc3-id，因此，lc3-ii/比值 的大小可估計(jì)自噬水平的高低。(注意: lc3對(duì)lc3-ii有更高的親和力，細(xì)胞培養(yǎng)，會(huì)造成假陽(yáng)性。方法2和3需結(jié)合使用，同時(shí)需考慮溶酶體活性的影響。)
4、mdc (monodansylcadaverine ，單丹---尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特---的。
5、celltrackertm green染色:主要用于雙染色，流式細(xì)胞檢測(cè)，但其能染所有的液泡，故也屬于非特---的。
流式細(xì)胞分選
流式細(xì)胞分選技術(shù)是利用流式細(xì)胞分選儀，以高能量激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下被熒光色素染色的單細(xì)胞或微粒，測(cè)量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強(qiáng)度，從而對(duì)細(xì)胞(或微粒)的物理、生理、生化、免yi、遺傳、分子生物學(xué)性狀及功能狀態(tài)等進(jìn)行定性或定量檢測(cè)的--種現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)，它可根據(jù)發(fā)射光的熒光強(qiáng)度和波長(zhǎng)將發(fā)光顆粒亞群分開(kāi)并可實(shí)現(xiàn)單ke隆分選，能復(fù)雜樣本中的細(xì)胞進(jìn)行鑒定、分類、定量和分離，單次可同時(shí)對(duì)其中一種到四種特定細(xì)胞進(jìn)行速分選純化、高通量單分選或細(xì)胞芯片制備。分選后的細(xì)胞能直接用于培養(yǎng)、移植、-提取、單細(xì)胞pcr擴(kuò)增或原位雜交等，瀘州細(xì)胞，可進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞基因、蛋白、功能水平的研究和不同細(xì)胞之間的差異化研究。硬件中樣本細(xì)胞丟棄的比例低于5%，---樣本中目標(biāo)細(xì)胞的高回收率。
大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)
方法：分離大鼠主動(dòng)脈，直接貼壁于培養(yǎng)皿中，熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，免yi組化ⅷ因子相關(guān)抗原染色鑒定細(xì)胞.結(jié)果:約24小時(shí)組織塊邊緣有游離的 新生細(xì)胞長(zhǎng)出，7天即融合成片.---傳代后細(xì)胞呈短梭形或三角形，單層生長(zhǎng)，鋪路石狀，ⅷ因子表達(dá)陽(yáng)性，呈指數(shù)增殖.凍存后復(fù)蘇細(xì)胞活性均超過(guò)90%.結(jié) 論:用貼壁法成功建立了大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，凍存細(xì)胞存活率高，為體外研究提供了穩(wěn)定的模型.
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