細胞實驗介紹——慢---建立穩轉細胞系
慢---包裝：公司使用3質粒慢---包裝系統，慢---系統使用plko.1-egfp、pspax2、pmd2.g，過表達慢---系統使用plvx-acgfp、pspax2、pmd2.g三質粒系統，將質粒混勻后使用磷酸鈣轉染方法轉染至hek293t細胞中，培養48h后，收集上清。使用genecopo公司慢---顆粒純化試劑盒將慢---純化。純化后留取部分檢測---滴度，其余---凍存于-80℃冰箱中。
滴度檢測：將---顆粒使用梯度稀釋，分別293t細胞，72h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達情況。根據細胞熒光量計算---滴度。
細胞：在---前---對細胞進行計數，接種約10000個細胞于12孔板中，培養過夜后使用無培養基稀釋---，加入12孔板中對細胞進行，---數量根據細胞的moi加入若無moi，需做---梯度：1，5，10，50，100 5個梯度對細胞，6h后去除含---溶液，加入完全培養基細胞培養，培養48h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光強度。同時加入puromycin對細胞篩選，篩選約2周時間。細胞篩選好后，使用定量pcr和western blot檢測目的基因的穩定表達情況。
實驗流程：慢---質粒構建-hek293t細胞培養-質粒轉染293t細胞----收集----純化----滴度檢測-細胞-穩轉細胞篩選-穩轉細胞鑒定
結果示例：
圖 a ---滴度檢測；b 目的細胞---效果圖
細胞實驗介紹——流式細胞術檢測細胞周期和凋亡
流式細胞術檢測細胞周期：
細胞周期：指細胞從-次分裂結束起到下一次分裂結束為止的活動過程，通常由g0/g1期、s期、g2期和m期組成。g0/g1期：有絲分裂發生，細胞分裂成兩個細胞，進入下一個細胞周期，或者進入靜止期g0期，而g0期從dna含量上無法與g1期區分，細胞開始rna和蛋白質的合成，但dna含量仍保持二倍體。s期：dna開始合成，細胞核內dna的含量介于g1期和g2期之間。g2期和m期：當dna成為4倍體時，細胞進入g2期。g2期細胞繼續合成rna及蛋白質，直到進入m期。
pi法是---的周期檢測方法。pi為插入性-熒光染料，能選擇性的嵌入-dna和rna雙鏈螺旋的堿基之間與之結合，其結合的量與dna的含量成正比例關系，用流式細胞儀進行分析，就可以得到細胞周期各個階段的dna分布狀態，從而計算出各個期的百分含量。
一般流程：細胞收集-70%酒精固定過夜-pi染色-流式細胞儀檢測。
細胞凋亡：細胞凋亡的早期就有細胞膜表面破損發生。破損時凋亡細胞表面的磷脂腺絲氨酸(ps)可以從細胞內膜翻轉至細胞的外膜。該過程發生在之前，檢測ps的表達，細胞生物學實驗，能反映早期凋亡。annexinv是ca2+依賴的磷脂結合蛋白，對ps有---的親和性，并且可以與暴露于細胞外的ps相結合。利用這一原理，可以將annexinv標記熒光來識別早期的細胞凋亡。通常利用annexinv-fitc和碘化丙啶(pi)來區分凋亡和壞---。pi的膜通透性很差，渭南細胞，因而只能標記壞死的細胞。
一般流程：細胞收集-pi-annexinv標記-流式細胞儀檢測。
結果示例：
圖 a 細胞周期檢測圖；b 細胞凋亡檢測圖
三、自噬過程進行觀察和檢測
1、觀察自噬體的形成
由于自噬體屬于亞細胞結構，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。phagophore的特征為:新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體(av1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結構，內含胞漿成分，如線粒體、內質網、核糖體等。自噬溶酶體(av2 )的特征為:單層膜，胞漿成分己降解。( autophagic vacuolo av )
2、在熒光顯微鏡下采用gfp-lc3融合蛋 白來示蹤自噬形成由于電鏡耗時長，不利于監測(monitoring) 自噬形成，人們利用lc3在自噬形成過程中發生---的現象開發出了此技術。無自噬時，gfp-lc3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時，gfp-lc3融合蛋白轉 位至自噬體膜，流式細胞技術，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當于一個自噬體，可以通過計數來評價自噬活性的高低。
3、利用western blot檢測lc3-ii/比值的變化以評價自噬形成自噬形成時，胞漿型lc3 (即 lc3-i)會酶解掉一小段多肽，轉變為(自噬體)膜型(即lc3-id，因此，lc3-ii/比值 的大小可估計自噬水平的高低。(注意: lc3對lc3-ii有更高的親和力，會造成假陽性。方法2和3需結合使用，同時需考慮溶酶體活性的影響。)
4、mdc (monodansylcadaverine ，單丹---尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，細胞融合實驗報告，故屬于非特---的。
5、celltrackertm green染色:主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特---的。
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