三、自噬過程進行觀察和檢測
1、觀察自噬體的形成
由于自噬體屬于亞細胞結構，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。phagophore的特征為:新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體(av1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結構，內含胞漿成分，如線粒體、內質網、核糖體等。自噬溶酶體(av2 )的特征為:單層膜，胞漿成分己降解。( autophagic vacuolo av )
2、在熒光顯微鏡下采用gfp-lc3融合蛋 白來示蹤自噬形成由于電鏡耗時長，不利于監測(monitoring) 自噬形成，人們利用lc3在自噬形成過程中發生---的現象開發出了此技術。無自噬時，gfp-lc3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時，gfp-lc3融合蛋白轉 位至自噬體膜，細胞系，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當于一個自噬體，---，可以通過計數來評價自噬活性的高低。
3、利用western blot檢測lc3-ii/比值的變化以評價自噬形成自噬形成時，胞漿型lc3 (即 lc3-i)會酶解掉一小段多肽，轉變為(自噬體)膜型(即lc3-id，因此，lc3-ii/比值 的大小可估計自噬水平的高低。(注意: lc3對lc3-ii有更高的親和力，會造成假陽性。方法2和3需結合使用，同時需考慮溶酶體活性的影響。)
4、mdc (monodansylcadaverine ，單丹---尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特---的。
5、celltrackertm green染色:主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特---的。
細胞生物學服務
南京英瀚斯生物科技公司自建有標準的細胞培養房，流式細胞技術，配備有生物安全柜、超凈工作臺、細胞三氣培養箱、---細胞培養箱、熒光倒置顯微鏡、體視鏡、、流式細胞儀等設備。細胞組---畢業于東南大學、華中科技大學等高校生物學相關，具有碩士研究生以上---，熟練掌握細胞學相關實驗，可開展多種細胞實驗。
平板克l隆形成實驗基本步驟::
1、取對數生長期的各組細胞，分別用0.25%胰 蛋白酶---并吹打成單個細胞，西藏細胞，并把細胞懸浮在10%胎牛的dmem培養液中備用。
2、將細胞懸液作梯度倍數稀釋，每組細胞分別以每皿50、100、200 個細胞的梯度密度分別接種含10ml 37預溫培養液的皿中，并輕輕轉動，使細胞分散均勻。置37團5% co2及飽和濕度的細胞培養箱中培養2~3周。
3、經常觀察，當培養皿中出現肉眼可見的時，終止培養。棄去上清液，用pbs小心浸洗2次。加4%---固定細胞5ml固定15分鐘。然后去固定液，加適量gimsa應用染色液染10~30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。
4、將平皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片，用肉眼直接計數，或在顯微鏡(低倍鏡)計數大于10個細胞的數。后計算形成率。形成率= (數/接種細胞數) x100%平板形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞一定要分散得好，不能有細胞團，接種密度不能過大。平板形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞- -定要分散得好，不能有細胞團，接種密度不能過大。
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