動物組織細胞基因組dna提取
操作步驟
1. 取新鮮或冰凍動物組織塊0.1g0.5cm3，盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉(zhuǎn)入1.5ml 離心管中，加入蛋白酶k
500ug/ml20μl，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，也可轉(zhuǎn)入37℃水浴12～24h，間歇振蕩離心管數(shù)次。于臺式離心機以12000 rpm離心5min，取上清液入另
一離心管中。
2.加2倍體積異，-，倒轉(zhuǎn)混勻后，可以看見絲狀物，用100ul 吸頭挑出，涼干，用200ul te 重新溶解。可進行pcr反應等，需要進一步純化的按下列步驟進行
3.加等量的酚??振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。
4.取上層溶液至另一管，pcr，加入等體積的?，振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。
5. 取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5mol/l氨加入2倍體積的無水-，混勻后室溫沉淀2min ，離心12000 rpm ，10min。
6.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。
7.用1ml 70%-洗滌沉淀物1次，離心12000 rpm ， 5min。
8.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，-怎么做，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。
9.加200ul te重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?c20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
10.吸取適量樣品于genequant上檢測濃度和純度。
分子與質(zhì)粒載體構(gòu)建
實驗原理
外源dna與載體分子的連接就是dna重組，pcr引物設計，這樣重新組合的dna叫做重組體或重組子。重組的dna分子是在dna連接酶的作用下，有mg2+、atp存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源dna分子進行連接。dna連接酶有兩種：t4噬菌體dna連接酶和大腸dna連接酶。兩種dna連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的dna分子連在一起的功能，而且t4噬菌體dna連接酶還有—種大腸連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈dna分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低，一般可通過提高t4噬菌體dna連接酶濃度或增加dna濃度來提高平末端的連接效率。
t4噬菌體dna連接酶催化dna連接反應分為3步：，t4dna連接酶與輔助因子atp形成酶—amp復合物；然后，酶—amp復合物再結(jié)合到具有5磷酸基和3-切口的dna上，使dna腺苷化；后產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。
dna重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法，為了防止載體本身的自連，可以通過(牛堿性磷酸酶)cip處理克服。
連接反應的溫度在37℃時有利于連接酶的活性.但是在這個溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此人們找到了一個折中溫度，即12-16℃，連接12-16h(過夜)，這樣既可大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又-到短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。
全轉(zhuǎn)錄組測序
全轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細胞在特定狀態(tài)下所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的總和，包括mrna和各種noncoding rna。我們知道生物體本身的轉(zhuǎn)錄過程是一個動態(tài)變化且十分復雜的分子作用網(wǎng)絡，如果只是對某個單一rna分子的研究，有時并不能準確的發(fā)現(xiàn)分子作用機制。而競爭性內(nèi)源rna(cerna)理論闡述了一種全新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式：cerna包括lncrna、circrna、mrna、假基因等分子能夠通過mirna應答元件microrna respe element， mre競爭性地結(jié)合相同的mirna來調(diào)節(jié)彼此的表達水平。舉個例子：mirna會導致基因沉默現(xiàn)象發(fā)生，而如果lncrna競爭性結(jié)合了mirna，從而影響了mirna基因沉默功能實現(xiàn)。
cerna是目前轉(zhuǎn)錄調(diào)控領(lǐng)域的-內(nèi)容之一，通過全轉(zhuǎn)錄組研究能夠系統(tǒng)性的闡述cerna的分子作用機制。目前對全轉(zhuǎn)錄組簡便的方法就是構(gòu)建2個測序-分別進行測序。標準的生物信息學分析能夠得到mrna、lncrna、circrna、mirna各自的研究內(nèi)容，靶向調(diào)控網(wǎng)絡、cerna網(wǎng)絡、共表達網(wǎng)絡分析可以將這幾種rna聯(lián)合起來分析，從而發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控網(wǎng)絡模型。去除rrna的鏈特--，含有的rna信息含量十分豐富，通過測序和生物信息學分析能夠得到mrna、lncrna、circrna的鑒定及注釋信息。不過該-構(gòu)建時會進行片段化選擇從而濾掉了small rna的信息，所以需要另外再構(gòu)建一個small rna-，進行測序分析后可以得到mirna和其他small rna的鑒定及注釋信息。全轉(zhuǎn)錄組測序方案路線圖如下所示：
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