分子實(shí)驗(yàn)介紹——印跡western blot檢測
通過sds-page凝膠將細(xì)胞或生物樣品內(nèi)的蛋白按照蛋白分子量從大到小規(guī)律分離開。經(jīng)過page分離的蛋白質(zhì)樣品，pcr實(shí)驗(yàn)室，轉(zhuǎn)移到固相載體例如纖維素薄膜或pvdf膜上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的起反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二起反應(yīng)目前主要用hrp標(biāo)記的第二，經(jīng)過底物顯色或自顯影以檢測電泳分離的特---目的基因表達(dá)的蛋白成分目前主要使用魯米諾和二-的hrp反應(yīng)發(fā)出熒光，通過儀器或者膠片顯色。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)流程：細(xì)胞收集-細(xì)胞裂解，蛋白提取-蛋白變性-sds-page電泳-蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜印記-蛋白封閉-目的孵育-二抗孵育-顯色拍照
結(jié)果示例：
圖 a不同大小的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，western blot檢測圖片；b a蛋白不同培養(yǎng)時(shí)間后western blot檢測圖片；c 使用image pro plus軟件對(duì)a蛋白灰度檢測，a蛋白表達(dá)變化統(tǒng)計(jì)圖
蛋白質(zhì)定量組學(xué)服務(wù)
細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組豐度的動(dòng)態(tài)變化對(duì)不同生命過程有重要影響。例如在許多---的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程中，pcr檢測，常常伴隨著某些蛋白質(zhì)的表達(dá)異常。目前定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)主要分為標(biāo)記(label)策略和非標(biāo)記的(label free)定量策略，pcr引物設(shè)計(jì)，其中標(biāo)記策略又分為體內(nèi)標(biāo)記(如 silac、15n 標(biāo)記)，以及體外標(biāo)記(如 itraq、tmt 標(biāo)記) 。
傳統(tǒng)的基于2d雙向凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)組通常可以鑒定出約1000種蛋白，對(duì)全蛋白質(zhì)組的覆蓋僅在5~10%左右，不能滿足高通量定量蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析的要求。我們結(jié)合樣品制備與高分辨率、高靈敏度的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，可在細(xì)胞與組織類樣品中鑒定直至多于10000個(gè)蛋白，對(duì)全蛋白質(zhì)組的覆蓋>;60%。結(jié)合生物信息學(xué)分析，pcr，為您構(gòu)建高通量蛋白質(zhì)定量表達(dá)譜。
mirna測序
microrna(mirna)是一種大小約21—23個(gè)堿基的單鏈小分子rna，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈rna前體經(jīng)過dicer酶加工后生成，不同于sirna雙鏈但是和sirna密切相關(guān)。microrna通過和靶基因mrna堿基配對(duì)引導(dǎo)沉默復(fù)合體risc降解mrna或抑制mrna的翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白表達(dá)新發(fā)現(xiàn)mirna也能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)。mirna在物種進(jìn)化中相當(dāng)保守，在動(dòng)物、植物和---等中發(fā)現(xiàn)的mirna表達(dá)均有嚴(yán)格的組織特---和時(shí)序性。mirna在細(xì)胞生長和發(fā)育過程中起多種作用，包括調(diào)控發(fā)育、分化、凋亡和增殖等。
目前研究mirna的方法主要是realtime-pcr、生物芯片技術(shù)以及第二代測序技術(shù)。基于第二代測序技術(shù)的mirna測序，可以一次獲得數(shù)百萬條mirna序列，能夠快速鑒定出不同組織、不同發(fā)育階段、不同---狀態(tài)下已知和未知的mirna及其表達(dá)差異，為研究mirna對(duì)細(xì)胞進(jìn)程的作用及其生物學(xué)影響提供了有力工具。
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