1、細胞準備：細胞傳到后，密度達到70％左右時進行轉(zhuǎn)染；
2、細胞轉(zhuǎn)染:取兩個ep管，一個加入opti-mem、---質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒；另一個加入opti-mem、lipo2000，然后將兩管混勻；
3、細胞孵育：將混合液逐滴加入細胞培養(yǎng)皿中，混勻后孵育；
4、收集---：轉(zhuǎn)染后48h、72h收集含慢---的上清；
5、滴度檢測:細胞為30%－50％時加入---上清液，pcr引物設(shè)計，檢測陽性細胞比例。
外顯子測序
外顯子組測序exome-seq是對定向富集的基因組dna進行高通量測序，它能夠以相對低的費用對人類外顯子組進行拷問。2009年，外顯子組捕獲工具的出現(xiàn)，讓外顯子組測序這種技術(shù)迅速紅起來。到目前為止，已有超過1萬個外顯子組被測序。
如今有多家公司推出了外顯子組捕獲試劑，包括羅氏nimblegen、安捷倫、illumina，還有現(xiàn)在的華大基因。這些方法究竟孰優(yōu)孰劣，斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)系的研究人員對市場上三個主流的外顯子組測序平臺進行了比較。該研究結(jié)果發(fā)表在《nature biotechnology》上。研究人員利用安捷倫、illumina和nimblegen的外顯子組測序平臺對同一個人類---樣品進行分析。他們的結(jié) 果表明，nimblegen平臺作為一個使用高密度重疊探針的平臺，盡管覆蓋了較少的基因組區(qū)域，但在靈敏檢測小的變異時所需的測序量也少。在同樣獲得80m測序數(shù)據(jù)的情況下，nimblegen有97%的目標序列達到10x以上的測序---，而其他產(chǎn)品只有90%。而安捷倫和illumina的探針能夠在低密度下捕獲更多數(shù)量的變異。此外，實時熒光定量pcr，illumina還捕獲了未翻譯的區(qū)域，pcr，這是nimblegen和安捷倫平臺無法靶定的。研究人員還比較了同一樣品的外顯子組測序和全基因組測序wgs，顯示外顯子組測序能夠檢測到wgs錯過的小變異。
除了文中提到了三個主流平臺，外顯子組捕獲方面的新產(chǎn)品也在不斷推出，fish檢測，研究人員的選擇也將更廣泛。羅氏nimblegen即將推出新一代的外顯子液相捕獲產(chǎn)品。這一新產(chǎn)品將可捕獲64m的基因組序列，包括外顯子以及mirna，它含與其他nimblegen液相捕獲產(chǎn)品相同的2.1m高密度探針，以高xiao、均一、特異、的定向捕獲。
蛋白提取
大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液， 少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于---、---等有ji溶劑中，因些，可 采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。
(一)水溶液提取法
稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度-于溶 解，縮短提取時間。但另一方面. ，溫度升高會使蛋白---性失活，因此，基于這一點考慮提取蛋白質(zhì)和酶時一般采用低溫( 5度以下)操作。為了避免蛋白質(zhì)提以過程中的降解，可加入蛋白 水解酶抑zhi劑(如二yi------，碘yi酸等)。
登錄后臺
