甲l基化特---的pcr
herman 等 1996 在使用重---酸鹽處理的基礎(chǔ)上新建的一種方法。該方法敏感性高，主要用于作定性研究。用------鹽處理基因組dna，所有未發(fā)生jia基化的胞嘧定被轉(zhuǎn)化為尿嘧ding，而jia基化的胞嘧定不變；隨后設(shè)計針對jia基化和非jia基化序列的引物進(jìn)行pcr。通過電泳檢測msp擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對處理后jia基化dna鏈的引物能得到擴(kuò)增片段，則說明該位點存在jia基化；反之，說明被檢測的位點不存在jia基化。
特點：適用范圍廣，能夠檢測特異位點是否發(fā)生jia基化。
------鹽測序法bisulfite sequencing pcr，bsp
------鹽修飾后測序法 bsp frommer 等 1992 提出的研究 dna jia基化方法，此方法---性及jing確度高，能明確目的片段中每一個 cpg 位點的jia基化狀態(tài)。用------鹽處理基因組dna，所有未發(fā)生jia基化的胞嘧ding被轉(zhuǎn)化為尿嘧ding，而jia基化的胞嘧ding不變。隨后設(shè)計bsp引物進(jìn)行pcr，實時定量pcr，在擴(kuò)增過程中尿嘧定全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧定，zui后對pcr產(chǎn)物進(jìn)行測序就可以判斷cpg位點是否發(fā)生jia基化，稱為bsp-直接測序法。將pcr產(chǎn)物克long至載體后進(jìn)行測序，可以提高測序成功率，安康pcr，這種方法稱為bsp-ke隆測序法。
特點：jing確度高，能夠準(zhǔn)確檢測出jia基化的程度百分比。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)
操作步驟
1.在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
1qpcr buffer
5 μl
dntp mix( 2mm )
4 μl
引物1(10pm)
μl 2
引物2 ( 10pm)
2μl
taq酶(2u/ul)
1 μl
dna模板( 50ng-1μg/μl )
1 μl
加ddh2o至
μl 50
視pcr儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2.調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，pcr檢測，立即置pcr儀上執(zhí)行擴(kuò)增。-般:在93°c
預(yù)變性3-5min ，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段: 93°c 40s***58°c 30s***72°c 60s ，循環(huán)30-35
次，后在72°c保溫7min。
3.結(jié)束反應(yīng)， pcr產(chǎn)物放置于4°c待電泳檢測或-20°c長期保存。
4. pcr的電泳檢測:如在反應(yīng)管中加有石蠟油，實時熒光定量pcr，需用100ul進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以
除去石蠟油;否則，直接取5- 10μl電泳檢測。
單細(xì)胞測序英語：single cell sequencing采取優(yōu)化的下一代dna測序技術(shù)ngs檢測單細(xì)胞的序列，可以獲得特定微環(huán)境下的細(xì)胞序列差異以方便研究其功能差異等。對個體細(xì)胞的dna測序可以幫助我們了解例如在中的小范圍細(xì)胞的變異；對其進(jìn)行rna測序可以幫助我們了解和鑒別不同的細(xì)胞類型與其表現(xiàn)的基因，對研究發(fā)育生物學(xué)等有較大裨益。
分離單細(xì)胞
在全基因組擴(kuò)增和測序前，有很多方法可以分離細(xì)胞個體，其中流式細(xì)胞術(shù)facs較為常用。個體細(xì)胞可以用顯微操作來收集，這樣較為快捷而且成本較低，但是比較有技術(shù)難度，而且顯微鏡下對細(xì)胞的錯誤分類容易影響實驗結(jié)果。激光捕獲顯微切割技術(shù)lcm亦可以用來收集單細(xì)胞。但是盡管激光捕獲顯微切割可以保留樣本細(xì)胞在組織中的空間位置，但是捕獲單細(xì)胞的時候容易連帶周圍細(xì)胞的物質(zhì)。高通量的細(xì)胞個體分離還可以使用微流控技術(shù)。微流控技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)都能準(zhǔn)確而自動地分離無偏樣本。但是，兩種方法都要求首先將細(xì)胞從其為環(huán)境中脫離，因此可能在rna表達(dá)分析中造成對轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)的干擾。
登錄后臺
