---性酶切分析法
---性酶切分析法是指基因組或一段---用---性內(nèi)切酶---產(chǎn)生的片段經(jīng)電泳等方法分離形成---的條帶圖譜，對(duì)dna序列的特征進(jìn)行的分析。---性酶是生物體內(nèi)能識(shí)別并切割特異的雙鏈dna序列的一種內(nèi)切---酶。它是可以將外來的dna切斷的酶，即能夠---異源dna的侵入并使之失去活力，但對(duì)自己的dna卻無損害作用。
---酶是基因工程中所用的重要切割工具。科學(xué)家已從原核生物中分離出了許多種---酶，并且已經(jīng)商品化，在基因工程中廣泛使用。根據(jù)---酶切割的特點(diǎn)，可將它們分為兩大類：一類是切割部位無特---的；另一類是可特---地識(shí)別核苷酸序列，即只能在一定的dna序列上進(jìn)行切割。
dna部分片段的連接
dna部分片段通過用每一種---性內(nèi)切酶過量---底物dna而獲得。這些片段隨后用t4 dna連接酶連接( 5′末端濃度為0.1-1.0 μm)。連接的片段然后用同一種---性內(nèi)切酶重切。僅當(dāng)3′和 5′末端都保留完整，連接反應(yīng)才會(huì)發(fā)生;而且只有那些識(shí)別位點(diǎn)完全恢復(fù)的分子才能被重切。切割后正常的帶型說明3′和 5′末端都是完整的，而且準(zhǔn)備的酶樣品中檢測不到---外切酶和磷酸酶。
質(zhì)粒載體和外源ｄｎａ中---酶切位點(diǎn)的性質(zhì)
如今，質(zhì)粒載體中---酶切位點(diǎn)的種類---繁多，因而通常都有可能找到某種帶---酶切位點(diǎn)恰恰與外源ｄｎａ部分片段本身-二致的載體。這就具備一個(gè)不可1比擬的優(yōu)點(diǎn)，也應(yīng)是可以用相應(yīng)的---酶---重組質(zhì)粒崦回收外源ｄｎａ。另一種方案，則是把片段插入到載體中能產(chǎn)生匹配末端的任何位點(diǎn)中。例如，識(shí)別不同的六核苷酸的---酶bamhl和bglⅱ產(chǎn)生具有相同---末端的---酶切片段，快切酶，這樣用bglⅱ---而制備的外源ｄｎａ部分片段可以克1隆到用banhl---的質(zhì)粒中。這通常會(huì)使接合序列不能被曾用于外源ｄｎａ或制備載體的任何一種酶所切開。然而很多清況下，用切點(diǎn)位于多克1隆序列側(cè)翼的---酶進(jìn)行---，可將片段從重組質(zhì)粒中摘出。偶爾在質(zhì)粒的以及外源ｄｎａ兩端的---酶切位點(diǎn)之間，不可能找到“門當(dāng)戶對(duì)”的搭配關(guān)系。這時(shí)可用下面兩種方案加以解決：
1在線狀質(zhì)粒末端和或外源ｄｎａ部分片段的末端接上合成在接頭或銜接頭。
2在得到控制的反應(yīng)條件下，用大腸桿1菌ｄｎａ聚合酶i ｋlenow片段部分補(bǔ)平帶3凹端的ｄｎａ部分片段。如第九章所討論，這樣常可以使那些不相匹配的---酶切位點(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa(bǔ)末端，從而促進(jìn)載體和外源ｄｎａ的連接。因?yàn)椴糠盅a(bǔ)平的反應(yīng)消除了同一分子兩端彼此配對(duì)的能力，故連接反應(yīng)過程中環(huán)化和自身寡聚化的機(jī)會(huì)也會(huì)有所降低
登錄后臺(tái)
