hot start pcr的原理
hot start pcr法是提高pcr特---的重要方法之一。這種方法可以防止在pcr反應(yīng)第yi步驟因引物的錯(cuò)配或引物二聚體的形成而導(dǎo)致的非特---擴(kuò)增，從而可以提高目的dna部分片段的擴(kuò)增效率。takara taq hot start version，takara ex taq hot start version，takara la taq hot start version，primestar hs dna polymerase，mightyamp dna polymerase是抗1體和dna聚合酶的混合制品。抗1體在高溫加熱前與聚合酶相結(jié)合，抑制聚合酶的活性。在pcr反應(yīng)zui初的dna變性步驟，抗1體變性，gdna去除反轉(zhuǎn)錄試劑盒，聚合酶活性恢復(fù)。
污染的監(jiān)測(cè)
一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè)，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。
1、陽性對(duì)照：在建立pcr反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有pcr陽性對(duì)照，它是pcr反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。陽性對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本，如以重組質(zhì)粒為陽性對(duì)照，其含量宜低不宜高100個(gè)拷貝以下。但陽性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標(biāo)本，其對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一pcr試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí)，在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽性對(duì)照。
2、陰性對(duì)照：每次pcr實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照。它包括：
1標(biāo)本對(duì)照：被檢的標(biāo)本是血1清就用鑒定后的正常血1清作對(duì)照；被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對(duì)照。
2試劑對(duì)照：在pcr試劑中不加模板dna或rna，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，以監(jiān)測(cè)試劑是否污染。
3、重復(fù)性試驗(yàn)。
4、選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。
基因分型
pcr可用于檢測(cè)特定細(xì)胞或生物體中等位基因的序列差異。例如，基因敲除和敲入小鼠等生物的基因分型[3]。引物對(duì)經(jīng)設(shè)計(jì)位于目標(biāo)區(qū)域側(cè)翼，可根據(jù)是否存在擴(kuò)增子及擴(kuò)增子長(zhǎng)度來檢測(cè)遺傳變異。
但是如果為了檢測(cè)特定核苷酸突變，則必須對(duì)擴(kuò)增的序列進(jìn)行進(jìn)一步分析。例如， pcr擴(kuò)增子測(cè)序就是研究單核苷酸變異snvs和單核苷酸多態(tài)性snp的方法之一。---使用高保真dna聚合酶，以防止在pcr過程中引入多余的突變。
通過pcr進(jìn)行基因分型也是對(duì)癌1癥和遺傳病中的 突變進(jìn)行遺傳分析的一個(gè)基本方式。
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